常见生殖道沙眼衣原体感染检测方法

　　沙眼衣原体( Chlamydia trachomatis，Ct）是目前常见的生殖道感染性病原体之一。据世界卫生组织（WHO）预计，每年新增Ct感染人数达1.3亿。Ct感染后有50-70%的患者无明显临床症状，女性则70-80%。然而，无论症状性感染和无症状感染均会导致后遗症，主要影响女性生殖系统，可能出现盆腔炎、异位妊娠和输卵管不孕。此外，Ct与人乳头瘤病毒和HIV的感染有关。由于Ct目前仍缺乏有效疫苗，对Ct的防治主要依赖于早期筛查、早诊断和早治疗，选择高效的实验室检测诊断方法对控制Ct感染具有重要的影响。

　　中国疾病预防控制中心性病控制中心于2007年制定了第一版《生殖道沙眼衣原体感染诊断指南》，2020年中心根据世界卫生组织指南和最新的研究结果对该指南进行了修订，新版指南将核酸检测作为生殖道沙眼衣原体感染检测的主要方法。

　　沙眼衣原体实验室诊断技术发展经历了三个阶段：第一阶段是沙眼衣原体细胞培养，即通过细胞培养来证明衣原体包涵体的存在；第二阶段是非培养阶段，相继建立了酶免疫方法（EIA）、直接免疫荧光法（DFA）和免疫层析法（ICT），直接检测样本中的沙眼衣原体抗原；第三阶段是核酸扩增技术（NAATs）阶段，如荧光PCR、链置换扩增技术、转录介导等温扩增技术等。下文则逐个展开简要介绍。

　　各样本采集方式

1. 　　尿液采集：采集清晨首次尿液或至少禁尿1h后的尿液，用无菌、无防腐剂的塑料器皿收集10-20mL前段尿液。
2. 　　尿道拭子：男性取材前1h内不排尿，采用男性拭子插入尿道内2-3cm，以旋转方式轻轻转动并保留5-10s后取出。女性可用手指自耻骨联合后沿女性尿道走向轻轻按摩尿道，用同男性相似的方法取材。
3. 　　宫颈拭子：采样时先用生理盐水湿润的扩阴器扩阴，无菌棉拭子清除宫颈口外面的分泌物，再将女性取材拭子插入宫颈管内1-2cm，稍用力转动，保留5-10s后取出。细胞刷采样：无菌棉拭子清洁宫颈口外表面，然后将细胞刷插入宫颈管内1-1.5cm，旋转数圈，停留数秒后取出。孕妇不应选择细胞刷采样方法。
4. 　　肛拭子：将取材拭子插入肛管2-3cm，接触侧壁10s，从紧靠肛环边的隐窝中采集分泌物。被粪便严重污染的拭子必须丢弃，更换拭子后重新取材。
5. 　　口咽拭子：用压舌板固定舌头，拭子越过舌根到咽后壁及扁桃体隐窝、侧壁等处，反复擦拭3-5次采集分泌物。
6. 　　阴道拭子：对青春期前女孩，将取材拭子放置于阴道后穹窿10-15s，采集阴道分泌物。对于处女膜完整的幼女需采用男性拭子，可通过处女膜孔采集阴道样本。
7. 　　常规阴道拭子采集可用温盐水湿润阴道窥器，轻轻按压子宫，打开窥器，使用试剂盒推荐的采样拭子放置于阴道后穹窿10-15s，采集阴道分泌物。
8. 　　眼结膜拭子：翻开下眼睑，从眼角向中间轻轻用拭子擦拭下眼结膜表面采集分泌物。

　　细胞培养

　　一、检测原理：

　　沙眼衣原体自身不能产生三磷酸腺苷（ATP），需依赖于宿主细胞提供。某些肿瘤细胞系可作为沙眼衣原体的易感细胞，经化学物质处理和离心使衣原体吸附于易感细胞。在适宜的培养条件下，沙眼衣原体以EB（原体）的形式侵入宿主细胞，被细胞膜包裹形成包涵体。内化的EB（始体）分化成代谢活跃、体积较大且有分裂能力的RB,RB以二分裂的方式增殖并发育为成熟的子代EB，包涵体逐渐胀大，48-72h后包涵体和宿主细胞破裂释放出成熟的EB，再重新感染易感细胞。培养物经染色后于显微镜下可见包涵体。

　　二、检测准备：

• 　　仪器设备：C02培养箱、倒置显微镜、生物安全柜、细胞培养瓶、细胞培养板、低温冰箱或液氮罐、离心机及水浴锅等。
• 　　细胞株：常用的敏感细胞株有McCoy、HeLa229或BHK-21细胞等。
• 　　检测试剂：胰酶-EDTA液、样本运输培养基、衣原体生长培养基、衣原体分离培养基、碘染色液、姬姆萨染色液及衣原体荧光单克隆抗体试剂等。

　　三、样本采集：

　　细胞培养支持多种样本类型，包括男性尿道样本、女性宫颈样本、直肠样本、口咽样本、眼结膜等样本。此外细胞培养还可利用鼻咽位样本。采集样本洗脱于运送培养基中保存在普通冰箱（2-8℃）内，24h内接种，超过24h应放置于低温冰箱（-20℃）保存。

　　四、检测流程：

　　1. 细胞复苏

　　将冻存的细胞管放置于37℃水浴中速溶（1min内），将已复温融化的细胞全部转移至已含有10 mL RPMI1640培养液的15mL离心管中，1000×g，离心5min，弃去上清液，加入适量培养液混匀后接种于培养瓶中，接种浓度1×106/mL左右，37℃，5%C02环境下培养过夜。次日更换生长培养基观察生长情况，及时传代。

　　2. 单层细胞制备

　　根据试验的目的可以选用不同孔的培养板进行试验，以下步骤以96孔培养板为例，其他孔培养板可参照表1的比例进行调整。提前将已灭菌处理0.25cm的盖玻片放入培养板孔内，注意观察盖玻片是否平铺于培养板孔中。加入适量的细胞及培养液，37℃、5%C02环境下培养48h，镜下观察细胞的形态及密度，待形成均匀覆盖孔底的单层细胞。

　　3. 样本接种与感染细胞

　　将保存于冰箱的样本放置于37℃水浴中速融。在已接种细胞的培养板孔中加入适量样本，每份样本接种2孔。同时每板设有阳性和阴性对照孔。将接种后的培养板放置于22-35℃、3000×g条件下离心1h。去除样本液，每孔加衣原体分离培养基0.1mL，放置于37℃、5%C02环境下培养48h，观察结果。试验孔处理：第1孔（放入的盖玻片上）进行碘染色、姬姆萨染色或荧光单抗染色。如第1孔阴性，则第2孔进行盲传，如为阳性，则保存菌种。

　　4. 染色鉴定

　　沙眼衣原体培养后可以通过碘染色和姬姆萨染色进行初步鉴定，通过直接免疫荧光法进行确证。

• 　　碘染色：弃去培养孔中的培养液，每孔加入0.2mL甲醇，固定感染细胞10min，弃去甲醇后加碘染色液染5~10min。在玻片上滴加1μL碘甘油封片，取出盖玻片，将细胞面朝下放在封固液上，显微镜下观察结果。
• 　　姬姆萨染色：培养孔弃去培养液，每孔加入0.2mL甲醇，固定感染细胞10min，弃去甲醇后加姬姆萨染色液染30min，在玻片上滴加1μL碘甘油封片，取出盖玻片，显微镜下观察结果。
• 　　直接免疫荧光法：感染细胞用甲醇/丙酮固定10min，弃去甲醇后加荧光标记单克隆抗体，37℃孵育30min，洗涤数次，取出盖玻片放置于载玻片上，用碱性甘油封片后在荧光显微镜下检查。

　　5. 结果判读

　　沙眼衣原体培养阳性时，碘染色镜检可见细胞内深棕色包涵体;姬姆萨染色可见细胞内紫红色包涵体;荧光单抗染色可见苹果绿色荧光的包涵体和原体颗粒。 图片

　　五、结果报告：

• 　　可见沙眼衣原体生长。
• 　　未见沙眼衣原体生长。

　　六、临床意义：

　　临床样本中见沙眼衣原体生长可作为诊断生殖道沙眼衣原体感染的依据，但培养法灵敏度不高，因此临床样本未见沙眼衣原体生长时不能排除患者有生殖道沙眼衣原体感染。

　　七、注意事项：

• 　　棉拭子含有对衣原体生长有影响的物质，取材后立即将样本洗脱到运输培养基后，弃去拭子。
• 　　样本取材后尽快接种，24h内不能接种应放置-70℃冰箱。
• 　　尿液、精液样本及服过抗生素和使用阴道制剂的患者样本不宜做衣原体培养。
• 　　单层细胞制备时如果细胞生长过密，包涵体染色过暗，侧应降低培养中的细胞浓度。
• 　　细胞生长稀疏、条束化，不能成片或被污染时，则应重新复苏细胞培养。细胞传代次数超过5代不可进行培养实验。
• 　　胎牛血清质量对细胞生长影响很大，应选择质量合格的血清。
• 　　放线菌酮的浓度对于衣原体生长影响较大，应根据实际情况而定。

　　培养法曾经被认为是检测沙眼衣原体感染的「金标准」方法。由于该法检测敏感性较低（50-80%），且设备和操作技术要求高，样本运输需低温以保持沙眼衣原体的活性，试验周期长（需3-5d），样本要求高，仅在专业实验室开展，用于科学研究、抗菌药物敏感性试验和方法学评价等。目前美国CDC在男童性侵和女童的生殖道外部感染的检测中推荐使用该方法。

　　抗原检测法

　　沙眼衣原体抗原检测方法包括免疫层析法、直接免疫荧光法。

　　一、免疫层析法

　　1. 检测原理：

　　样本中衣原体脂多糖抗原与胶体金或乳胶标记的衣原体单克隆抗体结合形成复合物，复合物通过毛细作用发生迁移，与固定有抗衣原体脂多糖的单克隆抗体结合显色。

　　2. 检测准备：

　　相应品牌的抗原检测试剂盒。

　　3. 样本采集：

　　该方法检测的适宜样本一般为宫颈样本和尿道样本。

　　4. 检测流程：

　　按照相应品牌的说明书操作即可，一般15-30分钟出结果。

　　5. 临床意义：

　　临床样本沙眼衣原体抗原检测阳性可作为诊断生殖道沙眼衣原体感染的依据，但该方法的敏感性较低，阴性结果不排除患者感染沙眼衣原体。

　　二、直接免疫荧光法

　　1. 检测原理：

　　荧光标记的抗沙眼衣原体单克隆抗体与样本中的沙眼衣原体结合，在荧光显微镜下可见绿色荧光的衣原体原体或包涵体。

　　2. 检测准备：

• 　　仪器设备：荧光显微镜。
• 　　检测试剂盒：包括荧光标记抗沙眼衣原体单克隆抗体、已知沙眼衣原体阳性和阴性对照片、磷酸盐缓冲液、碱性甘油封片剂。

　　3. 样本采集：

　　该方法检测的适宜样本一般为宫颈样本和尿道样本。

　　4. 检测流程：

• 　　样本片制备：将采集的拭子样本，均匀的涂布在玻片上，自然干燥后，滴加丙酮固定10min。
• 　　样本、阴性和阳性对照片各滴加荧光标记抗沙眼衣原体抗体。
• 　　放置于湿盒中，37℃孵育30min。
• 　　磷酸盐缓冲液洗涤数次，每次10min，自然干燥。
• 　　滴加碱性甘油后加盖玻片，荧光显微镜下观察结果。
• 　　结果判读：参照阴性、阳性对照片结果，观察试验样本。40x10倍镜下发现10个及以上单一针尖样绿色荧光的颗粒，判为阳性；每片可见小于10个单一针尖样绿色荧光的颗粒，判为可疑；未发现典型发绿色荧光颗粒，仅可见复染红棕色的细胞则为阴性。

　　5. 临床意义：

　　临床样本沙眼衣原体抗原检测阳性可作为诊断生殖道沙眼衣原体感染的依据，但该方法的敏感性较低，阴性结果不排除患者感染沙眼衣原体。

　　6. 注意事项：

• 　　样本采集后立刻制备样本片，制备涂片时拭子轻轻滚动且要涂布均匀。
• 　　使用的玻片应清洁，防止杂质引起的假阳性染色。
• 　　涂片边缘的浓集染色可能是由于荧光试剂干涸引起，会导致假阳性结果。

　　直接免疫荧光法法适用于多种标本，具有特异、快速的优点，但由于判读受主观因素影响，且荧光标记物不稳定，不适宜标本筛查。免疫层析法虽然敏感性较低，但因操作简单，省时快捷，对场地和设备要求低，目前在我国临床上仍被广泛应用。

　　核酸检测法

　　沙眼衣原体的核酸检测方法主要有实时荧光聚合酶链反应、链置换扩增技术、转录介导等温扩增技术、基因测序技术及基于核酸的POCT等。核酸检测主要通过扩增沙眼衣原体的7.5kb隐蔽性质粒DNA、染色体DNA或23S rRNA、16S rRNA等靶基因来检测病原体。目前最成熟的技术还是荧光PCR法。

　　由于全球新冠疫情的大流行，目前我国人群已经对实时荧光PCR检测的流程比较熟悉了，临床进行沙眼衣原体的流程主要也是样本采集—核酸提取—上机扩增—结果判读，具体操作细节会根据各个厂家不同试剂以及仪器而有所不同，因此这里不再赘述。

　　目前所有美国FDA批准的商品化核酸扩增检测产品均可适用于男性尿液和尿道拭子，女性宫颈分泌物、阴道分泌物及尿液，国内实时荧光PCR检测日前适用的样本主要为男性尿道拭子和女性宫颈拭子，尚不能应用于无创性样本（男性尿液、女性阴道拭子及女性尿液）的检测。国内外所有的核酸检测试剂目前对生殖道外的样本如直肠和咽部拭子均未被批准应用，因此建议在生殖道外部位检测出阳性的样本时，仍需要进一步的试验排除假阳性。

　　Nelson等对使用不同女性标本进行NAATs检测的准确性进行系统分析，得出阴道拭子( 临床采集或自采) 以及宫颈拭子均优于尿液检测结果的准确度.见下图：

　　对于男性人群，Chernesky等对男性尿道拭子和首段尿标本用 NAATs 进行评价，结果显示无论有无症状，尿液即可达到检测要求。 在主流的荧光PCR技术之外，基于核酸的POCT近年来也越来越受到关注。基于核酸的POCT方法可在封闭系统中自动进行样品制备、提取、扩增和检测，出具结果。目前也有一些品牌获得不同国家的认证，但是相关体系未来的普及性应用需要继续探索。

　　血清学检测

　　血清学试验对泌尿生殖道沙眼衣原体检测的敏感性和特异性不高，日前不推荐应用于急性无并发症的泌尿生殖道感染的诊断和筛查。在许多患者中，仅有侵入性沙眼衣原体才可以导致产生的抗体水平达到可检测的量，抗体水平可以保持许多年，且个体差异较大。近期，美国的研究团队正通过开发多抗原表位联合的检测手段，来提高血清学抗体检测的灵敏度和特异性。整体而言，新型血清学抗体检测方法仍处于探索阶段。

　　总结

　　鉴于50%男性和70%女性感染沙眼衣原体后表现为无状感染，建议对育龄期女性、性病门诊就诊者、有高危性行为的人群等进行筛查。核酸扩增技术具有敏感性高、特异性强以及高通量的优点，可用于生殖道沙眼衣原体感染的筛查与检测 。 

沙眼衣原体检测试剂

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