研究背景
酒精相关性肝病是肝移植的主要指征，也是死亡的主要原因。肠道菌群的改变与酒精相关性肝病的发病机制有关。酒精相关性肝病患者粪便中念珠菌的比例增加，但肠道念珠菌与其宿主之间的相互作用，尤其是它们对酒精相关性肝病的作用仍知之甚少。β-葡聚糖是许多共生真菌的细胞壁成分，与肝巨噬细胞上的C型凝集素结构域家族7成员A（CLEC7A；也称为DECTIN1）结合，以释放白介素-1β（IL-1β），增加小鼠酒精相关性肝病的严重程度。酵母白色念珠菌（C. albicans）通常以无害的形式存在于人体的肠道中，但在易感人群（例如免疫功能低下的患者）中可以从肠道转移到血液中。最近的研究表明Ece1是细胞伸长程度1（ECE1）基因的产物，对白色念珠菌的粘膜发病机制至关重要。Ece1-III 62-92K称为念珠菌溶血素，是一种分泌的溶细胞肽（外毒素），对宿主的上皮细胞损伤至关重要。在这项研究中，作者评估了白色念珠菌及其外毒素念珠菌溶血素在酒精相关性肝病中的作用。
研究结果
酒精性肝炎患者粪便中念珠菌溶血素阳性白色念珠菌数量增加
白色念珠菌是人体肠道菌群的常见真菌。作者通过ITS测序发现酗酒患者中白色念珠菌的比例增加。为了确定粪便真菌中活菌的含量，作者对对照组（对照，n = 11），酗酒患者（n = 42）和酒精性肝炎患者（n = 91）的粪便样本进行了真菌培养。结果发现与对照组和酗酒患者的培养物相比，酒精性肝炎患者的粪便样品中真菌或白色念珠菌明显增加。此外，与酗酒患者相比，酒精性肝炎患者中真菌或白色念珠菌的比例也增加。作者进一步检测了酒精性肝炎患者中编码白色念珠菌外毒素念珠菌溶血素的基因ECE1是否增加。结果发现30.77％的酒精性肝炎患者的ECE1检测呈阳性，而在酗酒患者中，这一比例显著降低。以上结果说明酒精性肝炎患者粪便中念珠菌溶血素阳性白色念珠菌数量增加。
念珠菌溶血素加剧了酒精相关性肝病
为了研究念珠菌溶血素阳性的白色念珠菌在酒精相关性肝病中的作用，作者在乙醇喂养期间反复对小鼠进行白色念珠菌（每三天108个CFU）灌胃处理。与PBS处理的小鼠相比，定植野生型白色念珠菌的小鼠出现更严重的乙醇相关性肝损伤，表现为血清ALT水平升高，肝脂肪变性增加，Il1b基因，趋化因子（C-X-C基序）配体1（Cxcl1）和Cxcl2的表达增加。为了确定这种疾病的恶化效果是否取决于ECE1，作者将ECE1基因缺失（ece1D / D）的白色念珠菌菌株定植在小鼠体内。这些小鼠的乙醇相关性肝损伤，脂肪变性和炎症程度较轻。将ECE1重新导入ece1D / D株（ece1D / D + ECE1）中，并用该菌株在小鼠体内定植，与乙醇处理后野生型白色念珠菌定植的小鼠产生的肝损伤，脂肪变性和炎症水平相当。这些结果表明ECE1的基因产物对于白色念珠菌加重乙醇相关性肝病至关重要。
ECE1编码由8种不同的肽组成的多蛋白，念珠菌溶血素是其中的一种分泌型的溶细胞肽外毒素。为了检测念珠菌溶血素是否导致ECE1介导的乙醇相关性疾病的增加，作者将携带Ece1-III62–93念珠菌溶血素编码区（ece1D / D + ECE1D184–279）缺失的白色念珠菌菌株在小鼠体内定殖，因此不产生念珠菌溶血素。与定植ece1D / D白色念珠菌菌株的小鼠相比，这些小鼠表现出相似的症状，表明念珠菌溶血素对于白色念珠菌加重乙醇诱发的肝病是必需的。此外，念珠菌溶血素与死亡率增加有关。与定植念珠菌溶血素阴性菌株的小鼠相比，定植念珠菌溶血素阳性菌株的小鼠死亡率显著增加。此外，白色念珠菌菌株不影响乙醇的肠道吸收或肝脏代谢，血清乙醇水平以及肝醇脱氢酶1（Adh1）和细胞色素P450家族2亚家族E多肽1（Cyp2e1）的表达，在各组之间没有显著差异。这些结果表明产生念珠菌溶血素的白色念珠菌可增加乙醇相关的肝病和小鼠的死亡率（图2）。
念珠菌溶血素加剧了乙醇诱导的脂肪性肝炎，而与骨髓源性细胞上的受体CLEC7A无关
β-葡聚糖是大多数真菌物种（包括白色念珠菌）中最丰富的细胞壁多糖。CLEC7A是一种模式识别受体，可识别多种β-葡聚糖，从而激活宿主免疫反应。 CLEC7A主要在髓样细胞上表达，仅在肝脏中的Kupffer细胞和巨噬细胞上表达。作者之前已经证明从Kupffer细胞中丢失CLEC7A会减轻乙醇诱导的脂肪性肝炎。为了研究白色念珠菌的促病作用是否由CLEC7A信号传导介导，作者用氯膦酸盐介导Kupffer细胞耗竭，辐射和骨髓移植相结合的方法，产生了CLEC7A骨髓嵌合小鼠。用野生型白色念珠菌，ece1D / D白色念珠菌（ece1D / D）或PBS处理嵌合小鼠，并进行长期乙醇喂养。与PBS处理的小鼠和定植ECE1基因缺失的白色念珠菌菌株的小鼠相比，缺少CLEC7A并被野生型白色念珠菌定植的嵌合小鼠表现出更严重的乙醇诱导的肝损伤，脂肪变性和炎症。在所有组中，均未观察到血清乙醇水平，Adh1和Cyp2e1表达的显著差异。这些结果表明在给予乙醇后，白色念珠菌和念珠菌溶血素可诱导肝脏疾病，这不依赖于Kupffer细胞和其他骨髓来源细胞的CLEC7A信号传导。
念珠菌溶血素不影响肠道通透性
在细胞培养系统中，念珠菌溶血素引起肠道上皮细胞坏死，这是白色念珠菌通过肠道转移的关键因素。为了确定念珠菌溶血素是否在体内诱发肠屏障功能障碍，作者通过测量葡聚糖的回收率来确定肠道通透性。与作者之前的报道一致，乙醇饮食小鼠的肠道通透性增加。但是乙醇处理后，在野生型白色念珠菌，ece1D / D白色念珠菌（ece1D / D）和PBS处理的小鼠中，未观察到明显差异。肠脂肪酸结合蛋白（IFABP）在肠上皮细胞中特异性表达，并在肠上皮细胞损伤后释放到体循环。作者通过ELISA对血清IFABP进行测定，发现两组之间的肠上皮损伤没有差异。这些结果表明在乙醇喂养的小鼠中，念珠菌溶血素不会引起肠屏障破坏或肠上皮细胞死亡。
念珠菌溶血素对原代肝细胞具有细胞毒性
为了进一步明确念珠菌溶血素加重乙醇相关性肝病的机制，作者从正常饮食或长期乙醇喂养的小鼠中分离了原代肝细胞。将培养的肝细胞与念珠菌溶血素共同孵育。与对照肽孵育的肝细胞相比，念珠菌溶血素剂量依赖性地导致培养的肝细胞死亡。与从对照组小鼠体内分离的肝细胞相比，乙醇喂养小鼠的肝细胞显示出相似的细胞毒性。但是乙醇孵育会增加念珠菌溶血素诱导的细胞毒性。这些结果表明念珠菌溶血素可以直接损伤肝细胞，并且在乙醇刺激下可以增加细胞毒性作用。
念珠菌溶血素与酒精性肝炎的严重程度和死亡率有关
酒精相关的肝病可能会发展为酒精性肝炎，具有很高的发病率和死亡率。因此，作者分析了酒精性肝炎患者的临床参数和结局，患者的粪便中念珠菌溶血素编码基因ECE1呈阳性。与ECE1阴性患者相比，含有念珠菌溶血素遗传物质的患者粪便样品的MELD评分更高。在单变量logistic回归分析中，MELD评分与ECE1的检测显著相关（表1）。酒精性肝炎患者中ECE1的检测与90天死亡率的增加进一步相关，调整后的危险比为3.01（1.02-8.87，p = 0.046）。此外，酒精性肝炎的ECE1阳性患者中有28.42％在入院90天内死亡，而ECE1阴性患者中有11.71％在入院90天内死亡（Log-rankp = 0.044），以上结果说明念珠菌溶血素与酒精性肝炎的严重程度和死亡率有关。
结论
酒精性肝炎患者的粪便白色念珠菌和ECE1水平升高。
念珠菌溶血素可加重乙醇诱导的肝病，并增加小鼠的死亡率。
念珠菌溶血素以剂量依赖性方式损害肝细胞。
念珠菌溶血素与酒精性肝炎患者的肝病严重程度和死亡率有关。
参考资料：Chu H, Duan Y, LangS, Jiang L, Wang Y, Llorente C, Liu J, Mogavero S, Bosques-Padilla F, AbraldesJG, Vargas V, Tu XM, Yang L, Hou X, Hube B, St?rkel P, Schnabl B. The Candidaalbicans exotoxin candidalysin promotes alcohol-associated liver disease. JHepatol. 2020 Mar;72(3):391-400.
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